1.PCR引物设计：主要关注扩增目标DNA片段的成功与否。通常，设计中需要确保引物与目标序列的准确结合，并避免引物二聚体形成和非特异性结合。
2.RT-qPCR引物设计：更加强调扩增的定量分析因素，如扩增效率和特异性。设计时需确保引物能在退火温度下达到理想的扩增效率，同时要避免非特异性扩增和引物二聚体的干扰。此外，需要对扩增曲线的线性范围进行优化，以获得精确的定量结果。
总体而言，PCR和RT-qPCR引物在设计上有一些共同要素，例如目标序列的匹配与长度的合理设置。然而，它们在用途和设计重点上存在显著差异。因此，PCR和RT-qPCR通常不使用相同的引物设计，必须根据各自的实验目的进行专门的设计优化。
一、RT\RTqPCR共同点
① 序列查找一致性：两者都需要设计引物在目标基因的保守序列上，以确保与广泛的样本达成有效结合。
② 保守区段选取：所选引物应位于基因的保守区段，以提高扩增的特异性和效率。
③ 避免连续配对：引物设计中应避免超过四个连续碱基的自身或引物间配对，以防引发非特异性结合或二聚体形成。
④ 避免发卡结构：必须防止引物形成环状发卡结构，这样结构可能会妨碍引物与模板的正确结合。
⑤ Tm值和GC含量：Tm值应在55－65℃之间，确保在适宜的温度下进行扩增；GC含量应保持在40%-60%，以增强引物的稳定性与结合能力。
⑥ Tm值差异：双引物的Tm值之间的差异应该小于2℃，以确保在相同的退火温度下具有相似的效率。
⑦ 3’端碱基设计：引物的3’端应避免出现三个或以上的相同连续碱基，以防止非特异性的扩增起始。
二、RT\RTqPCR不同点
1. 产物长度
①对于RT-qPCR，产物长度应控制在300bp以内，最理想的范围是80-150bp，以确保高效的扩增和准确的定量。过长的产物可能影响测定的灵敏度。
②PCR的产物长度可以更为灵活，通常范围在100-1000bp之间。如果需要扩增较长的片段，可以考虑分段扩增后再连接的方法。
2.引物特异性和扩增效率
RT-qPCR对引物的特异性和扩增效率要求更为严格。由于RT-qPCR主要用于定量分析，因此需要高灵敏的引物以及确保熔解曲线显示单一扩增产物，特别是在目标基因表达量较低的情况下。
3. 引物序列的设计：
在传统PCR中，引物设计常常包括添加酶切位点和保护碱基，以便为后续实验（如克隆）作准备。相比之下，RT-qPCR引物通常不需要这部分设计，更关注于扩增效率和产物的特异性，以保证结果的准确性。
